分析方法 | 脂質體藥物生物樣品分析的挑戰

  脂質體藥物指將一種或多種活性成分(API)包載於脂質體的脂質雙分子層內或(和)內水相內而形成載藥脂質體的一類藥物製劑 。
  作為藥物遞送載體 ，其具備生物相容性良好 、在體內可被生物降解以及定位靶向性強等優點 ，在一定程度上改善某些藥物在人體內的藥代動力學行為及藥效，減輕不良反應 。
  目前中國已經上市的脂質體藥物有注射用鹽酸多柔比星 、紫杉醇 、兩性黴素B 、鹽酸伊利替康脂質體注射液等 。
  脂質體藥物進入人體後 ，會釋放遊離型藥物 ，因而體內會同時存在負載型藥物和遊離型藥物 。負載型藥物是藥物的貯庫,遊離型藥物與藥效和不良反應有關 。
  因此 ，針對傳統劑型進行血漿總濃度分析的藥代動力學研究是不夠合適的 ，甚至可能對脂質體藥物產生誤導 。在進行脂質體藥物藥代動力學研究時 ，需要分別測定血液中遊離型藥物和負載型藥物的濃度 。
  遊離型藥物 ：從脂質體中釋放出來的藥物 ，在體內主要以遊離和血漿蛋白結合兩種形態存在
  負載型藥物 ：存在於脂質體中未被釋放的藥物
  總藥物 ：遊離型藥物+負載型藥物
  脂質體藥物在進入體內後 ，活性藥物一般會以遊離型與負載型藥物的形式存在 ，進行生物樣本分析時需要對二者進行有效分離 。分離生物樣本中遊離型/負載型藥物的常用方法包括平衡透析 、超速離心 、超濾 、固相萃取 、排阻色譜等 。選取的分離方法應防止脂質體製劑在分離的過程中發生泄漏或破裂 。
  對於體內遊離型或負載型藥物的測定主要包括直接法與間接法 。
  直接法 ：分別測定遊離型藥物和負載型藥物 ，更能準確體現暴露量 。
  間接法 ：測定總藥物濃度和遊離型藥物濃度 ，取二者差值即為負載型藥物濃度 。
  與普通藥物相比在生物樣本檢測方法建立過程中 ，遊離型和負載型藥物的分離以及如何保證含有脂質體的生物樣本在儲存 、前處理過程中的穩定是方法開發過程中所麵臨的挑戰 。由此而涉及到的校正標樣及質控樣本的製備 、基質效應 、選擇性 、回收率 、穩定性甚至離心轉速等方麵的考察 ，都與普通藥物有著不同的考量 。
  1-遊離型和負載型藥物分離方式選擇
  選用合適的分離方法是負載藥物和遊離藥物準確測定的先決條件 。樣品分離方法應滿足 ：
  ·快速、簡單 ，可用於高通量分析
  ·可有效分離各組分 ，以保證定量的準確性
  ·避免或減少脂質體在樣品製備和儲存過程中泄漏出藥物
  ·去除血漿中內源性基質的幹擾
  超濾法
  原理 ：遊離藥物通過超濾膜 ，而大分子的脂質體藥物被保留在上腔室中 。分離效果取決於選擇濾膜濾孔的大小 。
  適用範圍 ：蛋白結合率低的親水性化合物 。
  優勢 ：超濾過程簡單明了 、操作準確度高 。可以收集血漿後立即在現場直接進行 ，從而消除脂質體在血漿樣品中長期保存和凍融帶來穩定性問題的影響 。
  弊端 ：藥物可能被吸附到超濾裝置上，造成準確度的降低 。
  原理 ：填料與化合物的相互作用將遊離藥物保留在填料中 ，從而區分遊離藥物和負載藥物 。
  適用範圍 ：待測物能夠被固相填料吸附 ，且脂質體雙分子層表麵組分不與固相填料發生作用 ，能夠順利通過填料顆粒間的空隙流出 。
  優勢 ：可同時分析遊離藥物和負載藥物 。
  弊端 ：該操作複雜 、成本較高 ，需解決脂質體在血漿樣品長期保存和凍融帶來穩定性問題的影響 。
  脂質體的穩定性與多種因素相關 ，如pH 、溫度 、共存化合物 、滲透壓 、凍融次數等 。在遊離型藥物檢測時 ，脂質體在儲存及樣品處理過程中的穩定性十分關鍵 。
  如在上述過程無法保持脂質體的穩定性 ，在采集樣本後 ，應及時對其進行處理 ，如加入防凍劑 、控製溫度 、PH值 、緩衝液濃度等或將脂質體釋放的遊離型和負載型藥物進行分離後再分別進行貯存 ，以避免在冷凍貯存過程中脂質體發生破裂 ，幹擾後續脂質體藥物不同組分的測定 。
  3-離心轉速
  全血在離心製備血漿樣本過程中可能存在脂質體在血漿中分布不均的現象 。因此需要考察離心力對脂質體分層和滲漏的影響。可通過對不同離心力下血漿中脂質體和遊離藥物的峰麵積的差異測定來判定脂質體的均一性是否受到影響 ，從而選擇合適的離心力進行血漿樣本的製備 。另外 ，脂質體可能在渦旋混合的過程中發生滲漏 ，因此在製劑的配製過程中需要輕緩 ，盡可能低轉速混合樣本或者加入防振搖保護劑 。
  4-負載型藥物分析
  為了檢測負載型藥物中被脂質體包裹的藥物 ，需要使脂質體破裂以釋放藥物 。脂質體破封可以通過添加有機溶劑 、去汙劑 、pH調節劑或提高溫度等來進行 。
  5-質控樣品的設計
  因為脂質體樣品的不同成份可能會相互影響 ，為了使生物分析方法準確進行定量 ，應在適當的基質中製備校準標準樣品 ，質控樣品應模擬所產生樣品的組成 。可以通過將脂質體和遊離藥物分別加到血漿中來配製負載型藥物和遊離型藥物的校準曲線 ，質控樣品應同時包含負載型藥物和遊離型藥物 ，以便充分評估這兩種成分之間的相互影響 。
  硬件設施俱全
  彩運來醫藥生物分析服務平台專有實驗場地麵積超1300㎡ ，配備多套LC-MS/MS 、GC-MS/MS 、ICP-MS 、LOGAN全自動透皮擴散係統 、高速離心機等 。

  質量體係完善
  實驗室按照CNAS-CL01等認可文件建立了完善的管理體係 ，全流程“無紙化”辦公 ，數據監管可溯源 。
  項目經驗豐富
  ”722”之後 ，完成生物樣本檢測項目數量400+項 ，有使用SPE法和超濾法兩種前處理方式 ，完成鹽酸伊立替康 、多柔比星 、奧沙利鉑等多個脂質體臨床前體內藥代動力學研究的項目經驗 。項目團隊具備豐富的脂質體藥物研究經驗 ，也希望能為更多的脂質體藥物研究賦能 ，服務於更多的製藥公司和研發機構 ，縮短研發周期 、加快藥物上市 、造福更多的病患 。
  脂質體製劑組分複雜 ，在生物分析方法建立過程中存在不小的挑戰 。但始終離不開一個原則 ，即找到合適的分離方法區分遊離型和負載型藥物 ，並避免在整個分析測樣周期過程中脂質體藥物泄漏或釋放 ，從而影響測定結果 。